DNA-forstærkning gennem polymerasekædereaktion

PCR står for polymerasekædereaktion, en molekylærbiologisk teknik til amplificering af segmenter af DNA ved at generere flere kopier under anvendelse af DNA-polymeraseenzymer under kontrollerede betingelser. Så lidt som en enkelt kopi af et DNA-segment eller gen kan klones i millioner af kopier, hvilket tillader detektion ved hjælp af farvestoffer og andre visualiseringsteknikker.

Udviklet i 1983 har PCR-processen gjort det muligt at udføre DNA-sekventering og identificere rækkefølgen af ​​nukleotider i individuelle gener. Metoden anvender termisk cykling eller gentagen opvarmning og afkøling af reaktionen til DNA-smeltning og replikation. Når PCR fortsætter, bruges det "nye" DNA som en skabelon til replikation, og der sker en kædereaktion, hvor eksponentielt amplificering af DNA-skabelonen.

PCR-teknikker anvendes inden for mange områder af bioteknologi, herunder proteinteknik, kloning, retsmedicin (DNA-fingeraftryk), faderskabstestning, diagnose af arvelige og / eller infektionssygdomme og for analyse af miljøprøver.

Specielt inden for retsmedicin er PCR især nyttigt, fordi det forstærker selv den mindste mængde DNA-bevis. PCR kan også bruges til at analysere DNA, der er tusinder af år gammelt, og disse teknikker er blevet brugt til at identificere alt fra en 800.000 år gammel mammut til mumier fra hele verden.

Dette trin er kun nødvendigt for DNA-polymeraser, der kræver hot-start PCR. Reaktionen opvarmes til mellem 94 og 96 ° C og holdes i 1-9 minutter.

Hvis proceduren ikke kræver initialisering, er denaturering det første trin. Reaktionen opvarmes til 94-98 ° C i 20-30 sekunder. DNA-skabelonens hydrogenbindinger forstyrres, og der oprettes enkeltstrengede DNA-molekyler.

Reaktionstemperaturen er lavere til mellem 50 og 65 ° C og holdes i 20-40 sekunder. Primerne annealer til den enkeltstrengede DNA-skabelon. Temperaturen er ekstremt vigtig i dette trin. Hvis det er for varmt, bindes primeren muligvis ikke. Hvis det er for koldt, kan binderen muligvis binde ufuldstændigt. En god binding dannes, når primersekvensen nøje matcher templetsekvensen.

Temperaturen i dette trin varierer afhængigt af typen af ​​polymerase. DNA-polymerasen syntetiserer en helt ny DNA-streng.

Dette trin udføres ved 70-74 ° C i 5-15 minutter efter den sidste PCR-cyklus.

Dette trin er valgfri. Temperaturen holdes ved 4-15 ° C og afstrømmer reaktionen.

Under hver cyklus fordobles produkt (det specifikke stykke DNA, der replikeres).

Idet DNA-polymerasen mister aktivitet og forbruger reagenser, langsomt reaktionen.

Der akkumuleres ikke mere produkt.