Vejledning til oprettelse af en simpel fosfatbuffer

I kemi, a pufferløsning tjener til at opretholde en stabil pH, når en lille mængde syre eller base indføres i en opløsning. En phosphatbufferopløsning er især nyttig til biologiske anvendelser, der er specielt følsomme over for pH-ændringer, da det er muligt at fremstille en opløsning nær et hvilket som helst af tre pH-niveauer.

De tre pKa-værdier for fosforsyre (fra CRC-håndbog om kemi og fysik) er 2,16, 7,21 og 12,32. Monosodiumphosphat og dets konjugatbase, dinatriumphosphat, bruges normalt til at generere buffere med pH-værdier omkring 7 til biologiske anvendelser, som vist her.

• Bemærk: Husk, at pKa ikke let måles til en nøjagtig værdi. Lidt forskellige værdier er muligvis tilgængelige i litteraturen fra forskellige kilder.

At fremstille denne buffer er lidt mere kompliceret end at fremstille TAE- og TBE-buffere, men processen er ikke vanskelig og bør kun tage ca. 10 minutter.

For at fremstille din fosfatbuffer har du brug for følgende materialer:

• Monosodiumphosphat
• Dinatriumphosphat.
instagram viewer
• Fosforsyre eller natriumhydroxid (NaOH)
• pH-meter og sonde
• Volumetrisk kolbe
• Graduerede cylindre
• bægerglas
• Rør søjler
• Omrør kogeplade

Inden du laver en puffer, skal du først vide, hvilken molaritet du vil have den, hvilket volumen du skal lave og hvad den ønskede pH er. De fleste buffere fungerer bedst i koncentrationer mellem 0,1 M og 10 M. PH skal være inden for 1 pH-enhed for syre / konjugatbasen pKa. For nemheds skyld skaber denne prøveberegning 1 liter buffer.

Brug Henderson-Hasselbalch (HH) -ligningen (nedenfor) for at bestemme, hvilket forhold mellem syre og base er nødvendigt for at fremstille en buffer med den ønskede pH. Brug pKa-værdien nærmest din ønskede pH; forholdet henviser til det syre-base-konjugatpar, der svarer til det pKa.

HH-ligning: pH = pKa + log ([base] / [syre])

For en buffer med pH 6,9 er [base] / [syre] = 0,4898

Erstatning for [Acid] og Solve for [Base]

Den ønskede molaritet af bufferen er summen af ​​[syre] + [base].

For en 1 M-buffer er [Base] + [Acid] = 1 og [Base] = 1 - [Acid]

Ved at substituere dette i forholdsligningen, fra trin 2, får du:

[Syre] = 0,6712 mol / l

Løs for [syre]

Brug af ligningen: [Base] = 1 - [Acid], kan du beregne:

[Base] = 0,3288 mol / l

Når du har brugt Henderson-Hasselbalch ligning for at beregne forholdet mellem syre og base, der kræves til din puffer, forbered for knap 1 liter opløsning med de korrekte mængder monosodiumphosphat og dinatriumphosphat.

Brug en pH-sonde til at bekræfte, at den korrekte pH for bufferen er nået. Juster let efter behov ved hjælp af fosforsyre eller natriumhydroxid (NaOH).

Når den ønskede pH er nået, skal buffervolumenet bringes til 1 liter. Fortynd derefter bufferen som ønsket. Den samme buffer kan fortyndes til dannelse af buffere på 0,5 M, 0,1 M, 0,05 M eller noget derimellem.

Her er to eksempler på, hvordan en fosfatbuffer kan beregnes, som beskrevet af Clive Dennison, Institut for Biokemi ved University of Natal, Sydafrika.

Kravet er for en 0,1 M Na-phosphatbuffer, pH 7,6.

I Henderson-Hasselbalch-ligningen, pH = pKa + log ([salt] / [syre]), er saltet Na2HPO4, og syren er NaHzPO4. En puffer er mest effektiv ved sin pKa, som er det punkt, hvor [salt] = [syre]. Fra ligningen er det klart, at hvis [salt]> [syre], pH vil være større end pKa, og hvis [salt]

NaH2PO4 + NaOH - + Na2HPO4 + H20.

Når opløsningen er titreret til den korrekte pH-værdi, kan den fortyndes (i det mindste over en lille smule) rækkevidde, så afvigelsen fra ideel adfærd er lille) til det volumen, der giver det ønskede molaritet. HH-ligningen angiver, at forholdet mellem salt og syre snarere end deres absolutte koncentrationer bestemmer pH. Noter det:

• I denne reaktion er det eneste biprodukt vand.
• Molariteten af ​​pufferen bestemmes af massen af ​​syren, NaH2PO4, der vejes, og det endelige volumen, til hvilket opløsningen består. (Til dette eksempel kræves 15,60 g dihydrat pr. Liter endelig opløsning.)
• Koncentrationen af ​​NaOH er ingen bekymring, så enhver vilkårlig koncentration kan anvendes. Det skal naturligvis koncentreres nok til at bevirke den krævede pH-ændring i det tilgængelige volumen.
• Reaktionen indebærer, at der kun kræves en enkel beregning af molaritet og en enkelt vejning: kun én løsning skal udarbejdes, og alt det vejede materiale bruges i pufferen - det vil sige, der er ingen spild.

Bemærk, at det ikke er korrekt at afveje "saltet" (Na2HPO4) i første omgang, da dette giver et uønsket biprodukt. Hvis en opløsning af saltet udgøres, vil dets pH være over pKa, og det kræver titrering med en syre for at sænke pH-værdien. Hvis HC1 anvendes, vil reaktionen være:

Na2HPO4 + HC1 - + NaH2PO4 + NaC1,

hvilket giver NaC1 med en ubestemt koncentration, som ikke er ønsket i pufferen. Undertiden - for eksempel i en ionbytnings ionstyrke gradienteluering - er det påkrævet at have en gradient af for eksempel [NaC1] overlagret på bufferen. Der kræves derefter to buffere til de to kamre i gradientgeneratoren: startbufferen (det vil sige ækvilibreringsbufferen, uden tilsat NaC1 eller med startkoncentration af NaC1) og efterbehandlingsbufferen, som er den samme som udgangsbufferen, men som yderligere indeholder færdiggørelseskoncentrationen af ​​NaC1. Ved sammensætning af efterbehandlingsbufferen skal der tages højde for almindelige ioneffekter (på grund af natriumionen).

Eksempel som anført i tidsskriftet Biochemical Education16(4), 1988.

Kravet er for en ionstyrkegradientbehandlingsbuffer, 0,1 M Na-phosphatbuffer, pH 7,6, indeholdende 1,0 M NaCI.

I dette tilfælde vejes NaC1 ud og udgøres sammen med NaHEPO4; almindelige ioneffekter redegøres for i titreringen, og komplekse beregninger undgås således. For 1 liter puffer opløses NaH2PO4.2H20 (15,60 g) og NaC1 (58,44 g) i ca. 950 ml destilleret H20, titreret til pH 7,6 med en ret koncentreret NaOH-opløsning (men med vilkårlig koncentration) og fyldt op til 1 liter.

Eksempel som anført i tidsskriftet Biochemical Education16(4), 1988.