Gram Stain Procedure in Microbiology

Gram-pletten er en forskellig metode til farvning, der bruges til at tildele bakterie til en af ​​to grupper (gram-positiv og gram-negativ) baseret på egenskaberne af deres cellevægge. Det er også kendt som Gram-farvning eller Grams metode. Proceduren er navngivet til den person, der udviklede teknikken, den danske bakteriolog Hans Christian Gram.

Proceduren er baseret på reaktionen mellem peptidoglycan i cellevæggene i nogle bakterier. Gram-pletten involverer farvning af bakterier, fastgørelse af farven med en mordant, farvning af cellerne og anvendelse af et forsænk.

1. Den primære pletkrystal violet) binder sig til peptidoglycan, farvelægningsceller lilla. Både gram-positive og gram-negative celler har peptidoglycan i deres cellevægge, så indledningsvis pletter alle bakterier violet.
2. Grams iod (jod og kaliumiodid) påføres som et mordant eller fikseringsmiddel. Gram-positive celler danner et krystalviolet-iodkompleks.
3. Alkohol eller acetone bruges til at affarve cellerne. Gram-negative bakterier har meget mindre peptidoglycan i deres cellevægge, så dette trin gør dem væsentligt fargeløse, mens kun en del af farven fjernes fra gram-positive celler, som har mere peptidoglycan (60-90% af cellevæggen). Den tykke cellevæg af gram-positive celler dehydratiseres ved affarvningstrinnet, hvilket får dem til at krympe og fange indfarvet jodkompleks.
   instagram viewer
4. Efter affarvningstrinnet påføres et forsænk (normalt safranin, men undertiden fuchsin) for at farve bakterierne lyserøde. Både gram-positive og gram-negative bakterier henter den lyserøde plet, men den er ikke synlig over den mørkere purpur af de gram-positive bakterier. Hvis farvningsproceduren udføres korrekt, vil gram-positive bakterier være lilla, mens gram-negative bakterier vil være lyserøde.

Resultaterne af Gram-pletten ses ved hjælp af lysmikroskopi. Fordi bakterierne er farvet, identificeres ikke kun deres Gram-farvegruppe, men deres form, størrelse og klumpemønster kan observeres. Dette gør Gram-farven til et værdifuldt diagnostisk værktøj til en medicinsk klinik eller laboratorium. Mens pletten muligvis ikke helt sikkert identificerer bakterier, er det ofte tilstrækkeligt at vide, om de er gram-positive eller gram-negative til at ordinere et effektivt antibiotikum.

Nogle bakterier kan være gramvariabler eller gram-ubestemmelige. Selv denne information kan imidlertid være nyttig til at indsnævre bakteriel identitet. Teknikken er mest pålidelig, når kulturer er mindre end 24 timer gamle. Selvom det kan bruges på bouillonkulturer, er det bedst at centrifugere dem først. Den primære begrænsning af teknikken er, at den giver forkerte resultater, hvis der begås fejl i teknikken. Øvelse og dygtighed er nødvendig for at producere et pålideligt resultat. Et smittestof er muligvis ikke bakterielt. Eukaryote patogener pletter gram-negativ. Dog de fleste eukaryote celler undtagen svampe (inklusive gær) klarer sig ikke at holde sig til objektglaset under processen.

• Krystallviolet (primær plet)
• Grams iod (mordant, til at fikse krystalviolet i cellevæggen)
• Ethanol eller aceton (affarvningsmiddel)
• Safranin (sekundær plet eller forsænket)
• Vand i en sprøjteflaske eller dråbeflaske
• Mikroskopglas
• Forbindelse mikroskop

1. Læg en lille dråbe bakterieprøve på et objektglas. Varme fastgør bakterierne på objektglasset ved at føre den gennem flammen af ​​en Bunsen-brænder tre gange. Påføring af for meget varme eller for længe kan smelte bakteriens cellevægge, fordreje deres form og føre til et unøjagtigt resultat. Hvis der tilføres for lidt varme, vasker bakterierne objektglasset under farvning.
2. Brug en dropper til at påføre den primære plet (krystalviolet) på objektglaset og lad det sidde i 1 minut. Skyl forsigtigt objektglasset med vand højst 5 sekunder for at fjerne overskydende pletter. Skylning for længe kan fjerne for meget farve, mens ikke skylning længe nok kan tillade for meget plet at blive på gramnegative celler.
3. Brug en dropper til at påføre Grams iod på objektglaset for at fastgøre krystalviolet på cellevæggen. Lad det sidde i 1 minut.
4. Skyl objektglasset med alkohol eller acetone ca. 3 sekunder, fulgt straks med en mild skylning med vand. De gram-negative celler mister farve, mens de gram-positive celler forbliver violette eller blå. Hvis affarvningsapparatet dog er tændt for længe, ​​mister alle celler farve!
5. Påfør den sekundære plet, safranin, og lad den sidde i 1 minut. Skyl forsigtigt med vand højst 5 sekunder. De gramnegative celler skal farves røde eller lyserøde, mens de gram-positive celler stadig vises lilla eller blå.
6. Se diaset ved hjælp af et sammensat mikroskop. En forstørrelse på 500x til 1000x kan være nødvendig for at skelne celleform og arrangement.

Ikke alle bakterier identificeret ved Gram-pletten er forbundet med sygdomme, men nogle få vigtige eksempler inkluderer:

• Gram-positive coccier (rund):Staphylococcus aureus
• Gram-negative kokker:Neisseria meningitidis
• Gram-positive baciller (stænger): Bacillus anthracis
• Gramnegative baciller:Escherichia coli