Begrænsning endonukleaser er en klasse af enzymet der skærer DNA-molekyler. Hvert enzym genkender unikke sekvenser af nukleotider i en DNA-streng - normalt ca. fire til seks basepar lang. Sekvenserne er palindrome, idet den komplementære DNA-streng har den samme sekvens i modsat retning. Med andre ord skæres begge DNA-strenge på samme sted.
Hvor disse enzymer findes
Restriktionsenzymer findes i mange forskellige bakteriestammer, hvor deres biologiske rolle er at deltage i celleforsvar. Disse enzymer begrænser fremmed (viralt) DNA, der kommer ind i cellerne ved at ødelægge dem. Værtscellerne har et restriktionsmodificeringssystem, der methylerer deres eget DNA på steder, der er specifikke for deres respektive restriktionsenzymer, og derved beskytter dem mod spaltning. Mere end 800 kendte enzymer er blevet opdaget, der genkender mere end 100 forskellige nukleotidsekvenser.
Typer af restriktionsenzymer
Der er fem forskellige typer restriktionsenzymer. Type I skærer DNA på tilfældige steder så langt som 1.000 eller flere basepar fra genkendelsesstedet. Type III-skår på ca. 25 basepar fra stedet. Begge disse typer kræver ATP og kan være store enzymer med flere underenheder. Type II-enzymer, der overvejende anvendes i bioteknologi, skærer DNA i den anerkendte sekvens uden behov for ATP og er mindre og enklere.
Type II-restriktionsenzymer benævnes i henhold til den bakterieart, hvorfra de er isoleret. F.eks. Blev enzymet EcoRI isoleret fra E. coli. Det meste af offentligheden kender E. coli-udbrud i mad.
Type II-restriktionsenzymer kan generere to forskellige typer snit, afhængigt af om de skærer begge dele strenge i midten af genkendelsessekvensen eller hver streng tættere på den ene ende af genkendelsen sekvens.
Den førstnævnte skæring vil generere "stumpe ender" uden nukleotidoverhæng. Sidstnævnte genererer "klæbrige" eller "sammenhængende" ender, fordi hvert resulterende fragment af DNA har et overhæng, der komplementerer de andre fragmenter. Begge er nyttige i molekylær genetik til fremstilling rekombinant DNA og proteiner. Denne form for DNA skiller sig ud, fordi den er produceret ved ligering (binding sammen) af to eller flere forskellige strenge, der ikke oprindeligt var knyttet sammen.
Type IV-enzymer genkender methyleret DNA, og type V-enzymer bruger RNA'er til at skære sekvenser på invaderende organismer, der ikke er palindromiske.
Brug i bioteknologi
Restriktionsenzymer anvendes i bioteknologi til at skære DNA i mindre strenge for at undersøge fragmentlængdeforskelle blandt individer. Dette omtales som restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (RFLP). De bruges også til genkloning.
RFLP teknikker er blevet anvendt til at bestemme, at individer eller grupper af individer har karakteristiske forskelle i gensekvenser og restriktionsspaltningsmønstre i visse områder af genomet. Kendskab til disse unikke områder er grundlaget for DNA fingeraftryk. Hver af disse metoder afhænger af brugen af agarosegelelektroforese til adskillelse af DNA-fragmenterne. TBE-buffer, der består af Tris-base, borsyre og EDTA, bruges almindeligvis til agarosegel elektroforese at undersøge DNA-produkter.
Brug til kloning
Kloning kræver ofte indsættelse af et gen i et plasmid, som er en type af et stykke DNA. Restriktionsenzymer kan hjælpe med processen på grund af de enkeltstrengede overhæng, de forlader, når de udskærer. DNA-ligase, et separat enzym, kan forene to DNA-molekyler med matchende ender.
Så ved at bruge restriktionsenzymer med DNA-ligaseenzymer kan stykker DNA fra forskellige kilder bruges til at skabe et enkelt DNA-molekyle.