Teknikker til sekventering af DNA

Feltet af bioteknologi er en konstant forandring. Den hurtige vækst og udvikling af avanceret forskning er afhængig af innovation og kreativitet forskere og deres evne til at se potentialet i en grundlæggende molekylær teknik og anvende det på nye processer. Fremkomsten af ​​polymerasekædereaktion (PCR) åbnede mange døre i genetisk forskning, herunder et middel til DNA-analyse og identifikation af forskellige gener baseret på deres DNA-sekvenser. DNA-sekventering er også afhængig af vores evne til at bruge gelelektroforese at adskille strenge af DNA, der adskiller sig i størrelse med så lidt som et basepar.

I slutningen af ​​1970'erne blev to DNA-sekventeringsteknikker til længere DNA-molekyler opfundet: Sanger (eller dideoxy) -metoden og Maxam-Gilbert (kemisk spaltning) -metoden. Maxam-Gilbert-metoden er baseret på nukleotidspecifik spaltning af kemikalier og bruges bedst til at sekvensere oligonukleotider (korte nukleotidpolymerer, normalt mindre end 50 basepar i længden). Sanger-metoden er mere almindeligt anvendt, fordi det er bevist, at det er teknisk lettere at anvende, og med fremkomst af PCR og automatisering af teknikken, kan let anvendes til lange DNA-tråde, herunder nogle hele gener. Denne teknik er baseret på kædeafslutning med dideoxynukleotider under PCR-forlængelsesreaktioner.

I Sanger-metoden bruges den DNA-streng, der skal analyseres, som en skabelon, og DNA-polymerase anvendes i en PCR-reaktion til at generere komplementære strenge under anvendelse af primere. Der fremstilles fire forskellige PCR-reaktionsblandinger, der hver indeholder en bestemt procentdel af dideoxynucleosid-triphosphat (ddNTP) -analoger til en af ​​de fire nukleotider (ATP, CTP, GTP eller TTP).

Syntese af den nye DNA-streng fortsætter, indtil en af ​​disse analoger er inkorporeret, på hvilket tidspunkt strengen er for tidligt trunkeret. Hver PCR-reaktion ender med at indeholde en blanding af forskellige længder af DNA-strenge, som alle ender med det nukleotid, der var dideoxy-mærket til den reaktion. gel elektroforese derefter bruges til at adskille strengene af de fire reaktioner i fire separate baner og bestemme sekvensen af ​​den originale skabelon baseret på hvilke længder af strenge der ender med hvilket nucleotid.

I den automatiserede Sanger-reaktion anvendes primere, der er mærket med fire forskellige farvede fluorescerende tags. PCR-reaktioner, i nærvær af de forskellige dideoxynukleotider, udføres som beskrevet ovenfor. Dernæst kombineres imidlertid de fire reaktionsblandinger og påføres en enkelt bane af en gel. Farven på hvert fragment registreres ved hjælp af en laserstråle, og informationen indsamles af en computer som genererer kromatogrammer, der viser toppe for hver farve, hvorfra skabelon-DNA-sekvensen kan være fast besluttet.

Typisk er den automatiserede sekventeringsmetode kun nøjagtig for sekvenser op til et maksimum på ca. 700-800 basepar i længden. Det er imidlertid muligt at opnå fulde sekvenser af større gener og faktisk hele genomer ved anvendelse af trinvise metoder såsom Primer Walking og Shotgun-sekventering.

I Primer Walking sekventeres en brugbar del af et større gen ved anvendelse af Sanger-metoden. Nye primere genereres fra et pålideligt segment af sekvensen og bruges til fortsat sekventering af den del af genet, der var uden for rækkevidden af ​​de originale reaktioner.

Shotgun-sekventering indebærer tilfældigt at skære DNA-segmentet af interesse i mere passende (håndterbare) fragmenter i størrelse, sekventering af hvert fragment og arrangering af stykkerne baseret på overlapning sekvenser. Denne teknik er blevet gjort lettere ved anvendelse af computersoftware til at arrangere de overlappende stykker.