TBE-puffer (Tris-borat-EDTA) er en pufferopløsning, der består af Tris-base, borsyre og EDTA (ethylendiaminetetraeddikesyre). Denne buffer bruges ofte til agarosegelelektroforese i analysen af DNA-produkter, der er resultatet af PCR-amplifikation, DNA-oprensningsprotokoller eller DNA-kloningseksperimenter.
TBE-anvendelser
TBE-buffer er især nyttig til separering af mindre DNA-fragmenter (MW <1000), såsom små produkter fra restriktionsenzym fordøjer. TBE har en større bufferkapacitet og vil give en skarpere opløsning end TAE-buffer. TAE (Tris-acetat-EDTA) -buffer er en opløsning, der består af Tris-base, eddikesyre og EDTA.
TBE er generelt dyrere end TAE og hæmmer DNA-ligase, hvilket kan forårsage problemer, hvis der er påtænkt efterfølgende DNA-oprensning og ligeringstrin. Lær hvordan man laver TBE-buffer med de tre enkle trin, der følger. Det skal ikke tage mere end ca. 30 minutter at oprette.
Hvad du har brug for
For at gøre TBE-buffer skal du kun fire stoffer. De resterende varer på denne liste er udstyr. De fire krævede stoffer er EDTA-dinatriumsalt, Tris-base, borsyre og deioniseret vand.
Med hensyn til udstyr har du brug for en pH-måler og kalibreringsstandarder, alt efter hvad der er relevant. Derudover vil du have nogle 600 ml og 1500 ml bægerglas eller kolber. Afrunding af dit udstyrs behov er graderede cylindre, omrørestænger og omrøringsplader.
Kontroller opgørelsen på det laboratorium, du bruger, for at sikre dig, at du har alt, hvad du har brug for, inden du kommer i gang. Intet er værre end at skulle stoppe midt i forberedelsen af en løsning, fordi du er tom for de rigtige materialer.
Hvis dit laboratorium er i skole eller på dit arbejdssted, skal du tjekke med det rette personale for at se, at de har alle tingene på lageret. Det kan muligvis spare dig tid og energi i sidste ende.
Formelvægt forkortes som FW. Det er atomvægten af et element multipliceret med antallet af atomer i hvert element i en formel, hvorefter alle masserne af hvert element tilsættes.
Lageropløsning af EDTA
Der skal udarbejdes en EDTA-løsning på forhånd. EDTA går ikke helt ind i opløsningen, indtil pH-værdien er indstillet til ca. 8,0. For en 500 ml stamopløsning af 0,5 M EDTA, vejes 93,05 g EDTA-dinatriumsalt (FW = 372,2). Derefter opløses det i 400 ml deioniseret vand, og juster pH med NaOH (natriumhydroxid). Derefter fyldes opløsningen op til et slutvolumen på 500 ml.
Lageropløsning af TBE
Lav en koncentreret (5x) stamopløsning af TBE ved at veje 54 gram Tris-base (FW = 121,14) og 27,5 gram borsyre (FW = 61,83) og opløses begge i ca. 900 ml deioniseret vand. Derefter tilsættes 20 ml 0,5 M (molaritet eller koncentrationen) EDTA (pH 8,0) og juster opløsningen til et slutvolumen på 1 liter. Denne opløsning kan opbevares ved stuetemperatur, men der dannes et bundfald i ældre opløsninger. Opbevar pufferen i glasflasker og smid, hvis der er dannet bundfald.
Arbejdsløsning af TBE
Til agarosegelelektroforese kan en TBE-puffer anvendes i en koncentration på 0,5x (1:10 fortynding af det koncentrerede lager). Fortynd stamopløsningen med 10x i deioniseret vand. Endelig opløst koncentration er 45 mM Tris-borat og 1 mM (millimolær) EDTA. Bufferen er nu klar til brug i kører en agarosegel.